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滴度、空壳率、内毒素 | 您的rAAV载体能满足实验需求么?

时间:2022-03-25 热度:
 
重组腺相关病毒(recombinant Adeno-associated Virus, rAAV)是一种可以高效递送外源基因在体内稳定表达的病毒载体,被广泛应用于临床前基因功能研究和人类重大疾病的基因治疗,如视网膜疾病、血友病、神经系统疾病及心血管疾病等。尽管rAAV载体一直被认为是最安全的病毒载体之一。但仍有报道指出,在临床前研究和临床研究中,rAAV依然会在不同程度上诱导宿主免疫反应,这其中的原因包括病毒剂量、病毒载体质量、rAAV血清型、动物种属、外源基因性质等。
 
 

 

rAAV滴度

在基础科研、临床前研究和临床研究中,rAAV载体的剂量一直是影响科研数据和基因治疗效果的重要因素,rAAV基因组拷贝精确病毒滴定(即病毒滴度)也是rAAV载体质控的重要组成之一。rAAV滴度通常是通过测量衣壳蛋白或rAAV基因组来确定的
 

过去几年出现的几起rAAV基因疗法致死事件,均与接受高剂量rAAV有关,因此在实际研究或临床治疗中并非rAAV的剂量越高,效果就越好。研究报道,过高剂量的rAAV,随着衣壳剂量的增加,使得对衣壳特异性T细胞活化,诱导免疫反应从而清除转导的靶细胞,导致治疗效果丧失,甚至由于严重的免疫反应导致死亡。低剂量的rAAV有可能被anti-AAV抗体,甚至低滴度的中和抗体中和,从而导致效果不明显。因此精确的rAAV滴度测定、合适的载体剂量范围区间,是保证使用最佳效果的重要前提

 


 

图1 载体剂量与系统载体转染后效果之间的关系

(Mingozzi et al., 2013)

 

rAAV空壳率

rAAV载体的纯度要求和杂质控制是载体制备、纯化、质控过程中的重要因素,是顺利开展临床前实验和临床研究的先决条件。在rAAV载体制备过程中,除了含有全长DNA基因组的完整rAAV载体外,有一定比例的rAAV颗粒不含任何DNA基因组,被称为空病毒颗粒

 

大量空病毒颗粒的存在可能会影响rAAV载体的有效性和安全性,它们可能作为抗原的供应源,引起细胞免疫毒性;亦有可能竞争细胞表面受体结合位点,影响转录效率。因此优化生产工艺,探索控制空壳rAAV产生的办法;建立有效纯化方式,去除空壳rAAV是rAAV载体生产工艺重要任务,对于获得可靠、稳定、有效的研究数据至关重要。

 


 

图2 澳门太阳网城官网rAAV载体生产空壳率

电镜结果:包装DNA基因组的病毒颗粒为实心颗粒(红色箭头);空病毒颗粒中间存在空洞(黄色箭头)

 

rAAV内毒素

除空病毒颗粒等rAAV相关性杂质外, rAAV生产过程中残留的内毒素也可能是导致宿主免疫反应的原因之一。内毒素的释放主要是由细菌死亡自溶或粘附在其他细胞时造成的,也会发生在正常细胞生长和分裂过程中。因此,在rAAV载体制备过程中,无论是所需的质粒DNA、转染的293T细胞,亦或是生产环境均有可能引入内毒素

 

rAAV载体的内毒素可能会诱导宿主产生免疫反应,对细胞有较强的毒性作用,也会导致机体发热,引发全身性炎症反应,最终导致死亡。因此,无论是实验研究还是临床应用,都需要尽量去除载体的内毒素。rAAV载体中内毒素的去除有一定的局限性,成本高且载体回收率差,因此从源头上控制内毒素的产生尤为重要。

 

如何获得高质量的rAAV载体

随着rAAV载体的基础研究和临床应用的不断发展,使用高质量的rAAV载体可以为实验数据的稳定性和可靠性及临床治疗的安全性和有效性提供保障。

 

基于12年、30000+的病毒生产经验,澳门太阳网城官网持续优化病毒生产全流程,选择GMP级的质粒,官方授权的293T细胞完成病毒包装。建立标准三级细胞库,每月更换细胞,保证代次;优化质粒配比、病毒收获时间,借助超离、PEG沉淀、超滤、层析等科研及工业生产中的整合纯化工艺,持续降低rAAV载体的空病毒颗粒及内毒素残留,经多次随机检测rAAV载体空壳率<2%、内毒素含量均<2.5EU/mL,远超出行业标准。同时,对生产的每批rAAV产品在出库前均会进行物理滴度测定,通过qPCR绝对定量的方式进行基因组拷贝数测定和考马斯亮蓝染色检测病毒衣壳蛋白,以保证产品的滴度准确。

 

 

 

 
 
 
 

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参考文献

 

[1] Mingozzi F, High KA. Immune responses to AAV vectors: overcoming barriers to successful gene therapy. Blood. 2013 Jul 4;122(1):23-36. doi: 10.1182/blood-2013-01-306647. Epub 2013 Apr 17. PMID: 23596044; PMCID: PMC3701904.

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