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你的慢病毒表达的LncRNA准确吗?

时间:2022-03-23 热度:
 
 
慢病毒是一类改造自人免疫缺陷病毒的病毒载体,基因组是RNA,可将外源基因整合到基因组中实现稳定表达,借助慢病毒载体可以进行编码基因和非编码基因的过表达、干扰、敲除和内源性激活等操作,满足不同的基因操作需求。慢病毒的宿主范围广,免疫原性低,基因容量大,可以长期表达等特点,使其能够有效地感染培养的肿瘤细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞,此外,借助慢病毒载体改造T 细胞用于CAR-T细胞治疗。
 
 

 

长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸,不具有蛋白编码能力的线性RNA分子,基因组DNA转录生成lncRNA后,一些lncRNA在细胞核内发挥功能,另外一些lncRNA被转运到细胞质,在细胞质中lncRNA可以调控mRNA稳定性、翻译效率和干扰蛋白翻译后修饰。

 

LncRNA分类

LncRNA根据其相对位置在调控靶编码基因中发挥重要作用,根据其在基因组上与编码基因相对位置的不同,可以将lncRNA分为以下几类(见图1):1.启动子区(来自启动子区域的转录本);2.内含子间(主要产生于编码基因的内含子区);3.双向(与蛋白质编码基因共享相同的启动子,但转录方向相反);4.正义链(转录方向与蛋白质编码基因方向相同,存在于同一编码基因正义链,具有重叠的外显子);5.反义链(转录方向与蛋白质编码基因方向相反,存在于反义链,至少有一个外显子重叠);6.3’UTR区(来自3’UTR区域的转录本);7.基因间(来自于两个蛋白质编码基因之间的DNA序列)。与mRNA类似,lncRNA也可以存在于细胞核或细胞质中,但主要位于细胞核。

 

 

 

图1 长链非编码RNA分类

来源:Xiaomei Huang et al., Canner Lett. 2018

 

LncRNA对基因表达的调控

由于lncRNA的复杂性和多样性,不能简单地根据其结构或序列来描述其功能,但lncRNA的一个重要作用是调节邻近蛋白编码基因的表达。LncRNA在不同水平上调节基因表达:

 

表观遗传修饰

表观遗传修饰是指在细胞核DNA序列不发生变化的情况下,基因表达发生可逆和可遗传的变化,这种修饰包括染色质重塑、DNA甲基化和组蛋白修饰。

1.组蛋白乙酰化:组蛋白乙酰化的过程促进了基因表达、蛋白质活性或生理过程。

2.染色质修饰复合物的招募:lncRNA将染色质修饰复合物招募到特定的位点,介导相关基因的表达或沉默。

3.DNA甲基化:通过改变染色质结构、DNA构象、DNA稳定性以及DNA与蛋白质的相互作用来控制基因的表达。

 

转录调控

4.转录调节:LncRNA可抑制靶基因转录因子活性,抑制其基因表达。如lncRNA的转录干扰临近基因的表达;lncRNA通过封阻启动子区域干扰基因表达;lncRNA与RNA结合蛋白作用,定位到基因启动子区调控基因表达;lncRNA能调节转录因子活性,调控基因表达。

 

转录后调控

5.可变剪接:LncRNA可以促进pre-mRNA和可变剪接因子的结合,有助于产生成熟mRNA。

6.竞争性RNA:LncRNA可以作为miR海绵,竞争miRNA,然后解除对靶基因的抑制。

7.蛋白去磷酸化:LncRNA参与蛋白去磷酸化。

8.抑制蛋白降解:LncRNA与蛋白质相互作用并抑制其泛素化降解。
 

 

 

图2 LncRNA在不同水平上调节基因表达

来源:Xiaomei Huang et al., Canner Lett. 2018

 

 

LncRNA虽然不能编码蛋白质,但可以向下游传递信息,调控基因表达,表明lncRNA可能作为基于RNA的信息库,具有与蛋白质组学竞争的能力,在疾病诊断和靶向治疗中甚至比蛋白质更加敏感和特异。因此lncRNA的研究越来越广泛。

 

慢病毒包装系统缺陷

但是,目前lncRNA慢病毒包装系统普遍存在一些问题:

1.慢病毒是RNA病毒,lncRNA的转录终止需要polyA,而polyA会导致慢病毒包装过程中,慢病毒基因组的表达提前终止,导致慢病毒包装不成功;

2.常规慢病毒载体表达lncRNA,由于不能及时终止,会带有WPRE等无关序列,从而影响lncRNA的高级结构, 而高级结构是lncRNA发挥功能的决定性因素, 这些多余的序列势必对lncRNA的功能造成不可预料的影响;

3.有些lncRNA会发生自切割,包装时,慢病毒基因组也可能因为lncRNA的自切割而发生断裂,导致出毒失败。

 

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验证结果:

PCR验证表达精确:  
 

 


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参考文献

[1] Xiaomei Huang,Xi Zhou., et al. Advances in esophageal cancer: A new perspective on pathogenesis associated with long non-coding RNAs.Cancer Lett.2018 Jan 28;413:94-101.doi: 10.1016/j.canlet.2017.10.046.

 

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