肿瘤微环境 (TME) 在肿瘤发生、发展、转移和药物敏感性中发挥重要作用。基于肿瘤-免疫系统相互作用模式，将 TME 分为四种主要类型“Hot”、“Cold”、“IMS”、 “IME”。据报道，在一些肿瘤中，如结肠癌和黑色素瘤，TME温度越高，患者生存率越高。然而，TME的高度异质性仍然是理解和治疗癌症的一个关键障碍。原发性中枢神经系统淋巴瘤 (PCNSL) 是一种高度侵袭性非霍奇金淋巴瘤，见于中枢神经系统 (CNS)，包括脑、脊柱、脑脊液 (CSF) 和眼，PCNSL患者的生存率通常较低。尽管已在单细胞水平上研究PCNSL 的细胞组成和基因表达模式，但缺失了空间定位信息。因此，结合空间转录组测序来阐明 TME 的空间和时间发展模式以及关键的发生机制具有重要意义。
结果1 PCNSL TME图谱分析
从PCNSL患者的单细胞转录组测序数据中获得14964个细胞，共注释出5个细胞类型（T 细胞、巨噬细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞和癌细胞）。因考虑到 T细胞在TME 环境中的重要性，将其进一步分为7个T细胞亚群：CD4+ naïve、Treg、CD4+ exhausted、effect memory T-cell (TEM)、CD8+ naïve、CD8+ toxic T-cell (TOX)、CD8+ exhausted cell。同时对每份样本进行评分，将样本分为4类，分别为：“Hot” TME、“Cold” TME、“IMS” TME、“IME” TME；并选择4个代表性肿瘤组织进行空间转录组测序分析。
图1 PCNSL TME图谱分析
结果2 PCNSL TME的空间异质性分析
结合免疫评分和免疫微环境特征，选择4个典型样本进行空间转录组测序。采用每个celltype 的top 30 进行对每一个spot进行评分，对空转数据进行细胞类型映射注释。考虑到TME 中肿瘤细胞的异质性，将肿瘤细胞注释成不同的细胞亚群（图2A）。在Cold TME中，只有少数 T 细胞浸润，肿瘤细胞在空间水平上形成明显的簇（图2B）。对于另外两种中间状态，IMS TME中只有少量 T 细胞和巨噬细胞聚集在肿瘤区域的边界，肿瘤细胞似乎具有更明显的空间异质性，肿瘤的外部和内部形成不同的簇（图2C）。IME TME被定义为侵袭性边缘有大量免疫细胞的状态, 肿瘤异质性和物种空间分布更为明显，肿瘤细胞由内向外移动形成“onion cascading structure”，每层似乎状态不同（图2D）。结果表明，肿瘤细胞形成了特殊的空间分布，可能有其各自分工。
图2 PCNSL TME 的空间形态和异质性
结果3 PCNSL 细胞亚群注释
为了进一步探索每个肿瘤簇的特异性功能，对每个cell cluster的all DEG进行GO富集分析，默认采用 top10 GO terms来阐述其功能。基于免疫通路的GSVA评分来判定肿瘤是处于被动防御还是侵袭状态（图3A和3B）。结果发现，Hot中大部分肿瘤细胞处于被动防御状态，而Cold中的肿瘤细胞基本失去了免疫细胞的监督，处于负性免疫调节状态。对于 IMS，两种状态共存；IME处于免疫抑制状态。
通过注释每种Cancer cell 功能以进一步阐明了肿瘤的空间异质性。将Hot中的被动防御肿瘤细胞定义为“defenders”，主要分布在Cancer cell 1和Cancer cell 2；从空间位置来看，主要分布在上半部分。Cancer cell 3具有非常强的固醇代谢功能以对抗免疫细胞，因此将其定义为“attacker”。Cancer cell 4和Cancer cell 6分散在整个空间中，负责细胞运动和能量供应，因此将其命名为“engineers”和“energy suppliers” （图3C）。Cold肿瘤中，没有处于免疫防御状态的癌细胞，表现出很强的负性免疫调节能力；值得注意的是，有一簇高度增殖的癌细胞（Cancer cell 2），将其命名为“aggressors” （图3C）。IMS 肿瘤中的癌细胞状态与前两种状态具有相似性，但也有其自身的差异。与 T 细胞直接接触的 IMS 肿瘤中的Cancer cell 2显示出正性和负性免疫调节状态，并且似乎处于聚集 T 细胞的过渡阶段，而相对靠近内部的Cancer cell 1和3显示出较强的增殖特征。由于Cancer cell 4在 IMS 肿瘤中的主要功能是 ncRNA 的代谢重编程，它被命名为“organizers”(图3C)。在 IME 肿瘤中也发现了相同的簇（organizers），似乎栖息在空间位置的核心，空间位置叠加在肿瘤的内部区域上。以Cancer cell 4为中心向外延伸，周围的Cancer cell 5与其相似，具有较强的 ATP 代谢能力(图3C)。
图3 PCNSL细胞亚群的功能注释及空间分布分析
结果4 TME 中重塑模式和免疫压力传感模型
对 PCNSL 肿瘤亚群进行功能注释后，发现一些癌症簇似乎具有很强的相关性和相似性，因此，探索了TME 中肿瘤细胞簇的发育轨迹。结果表明，Hot肿瘤作为发展的起点，在晚期有两种不同的细胞命运，一种是cold tumor，另一种为IME tumor，将这种肿瘤细胞的进化形式称为“TME remodeling pattern”(图4A)。Gene Switch 分析获得了热肿瘤向冷肿瘤发展，以及 IME 肿瘤发展的关键开关基因（图4B）。
通过这种方式，将4个微环境中不同的肿瘤细胞亚群联系在一起，了解它们的相互关系和发育轴（图4C）。在经历了免疫细胞的挑战后，defenders衍生出attackers，attackers在免疫细胞压力较低的情况下生成aggressors扩大肿瘤；而organizers则衍生出组织肿瘤细胞构建免疫细胞高压区域的屏障环境，如血管分布较大的 IME 环境。将这种对肿瘤细胞选择性命运的免疫压力形式称为“Immune pressure-sensing model” （图4C）。
图4 TME 重塑模式和免疫压力感知模型
结果5 FKBP5+ 亚群促进了TME remodeling pattern的形成
为探索organizers在血脑屏障中的关键作用，进行WGCNA分析，筛选出了2个与organizers具有显著性关联的模块（blue modules、green modules）；随后通过模块基因的互作网路分析，最终筛选出 10 个与患者生存密切相关的基因（图 5A-C）。考虑到organizers的形成过程与肿瘤的进展相关，因此基于GEPIA和TCGA数据库对这些基因进行进一步分析，发现FKBP5 与患者的肿瘤进展密切相关（图 5C）。
图5 FKBP5+ 亚群促进TME remodeling pattern 形成
结果6 TME remodeling pattern的分子机制
TME中T细胞的状态尤为重要，因此通过细胞通讯分析了肿瘤细胞亚群与不同T细胞亚群之间的相互作用。在Hot肿瘤中，发现CD8 TOX T细胞与其他细胞的交流最为密切，其中CXCR4-CXCL12 信号轴尤其重要，CXCR4-CXCL12信号轴在热 TME 中被广泛激活（图6A和6B）。在Cold肿瘤中最重要的是 CD99 信号轴，CD99信号轴广泛分布在整个Cold TME 中（图6B）。IMS肿瘤各细胞群之间的通讯相对比较密集，ITGAM + ITGB2-ICAM1信号轴具有最重要的意义，该信号轴的最终接受者是免疫细胞和肿瘤细胞，代表了肿瘤细胞和免疫细胞在这种状态下的剧烈变化。同时，ITGAM + ITGB2-ICAM1信号轴的空间分布也集中在肿瘤细胞与 T 细胞紧密接触的区域，进一步反映了该区域强烈的免疫反应(图6B和6C)。对于 IME肿瘤，信号网络的中心是 CD4 exhausted T cells，整个 TME 中的细胞间相互作用远弱于其他TME；其中ANXA1-FPR1信号轴最重要，构建屏障环境和加强紧密连接的信号轴处于次要位置；ANXA1-FPR1信号轴作用于CD4- exhausted T cells 和 CD8- exhausted T cells，使其处于抗炎状态（图6B 和6C）。屏障环境和加强细胞间紧密连接的信号轴使免疫细胞难以进入肿瘤。这些结果表明，耗竭T 细胞大多数是聚集在侵袭性边缘的 T 细胞，进一步表明促进 T 细胞耗竭的各种分子可能起着至关重要的作用，这对于肿瘤免疫治疗非常重要。
图6 TME中肿瘤细胞与各个T细胞亚群之间的细胞互作关系
结果7 肿瘤免疫治疗靶点的空间表达分析
在目前的肿瘤免疫治疗中，免疫检查点分子抑制剂和 CAR-T 治疗已被证明是最有效的。通过探究免疫检查点分子及其相应配体的空间表达，发现免疫检查点分子及其受体在不同的 TME 中可表现出明显的时间和空间异质性。PD-L1的表达分布在Hot TME中，并在该发育阶段结束时表现出表达增加的趋势（图7A）。在IMS TME中，PD-L1表达集中在肿瘤细胞和免疫细胞的侵袭性边缘，与 PD-1 充分结合，促进 T 细胞耗竭。在Cold TME和 IME TME中，肿瘤细胞似乎已占主导地位，并逐渐降低。
在 CAR-T 疗法中，主要靶点 CD19 也具有独特的空间表达差异。在Hot TME中， CD19 表达相对较弱，但在Cold TME和 IMS TME中，CD19表达显著增加。在 IME TME中，高表达 CD19 的肿瘤细胞甚至被包裹在肿瘤内部，使得 CAR-T 细胞难以发挥靶向作用，这很可能是治疗效果大大降低的原因之一（图7B）。
这些结果表明，免疫治疗中分子的表达可能并不是简单的幅度变化或随时间的动态变化，它们的表达很可能伴随着空间位置的独特变化。如果我们能够利用这类分子独特的表达模式，将更有利于提高免疫治疗的准确性和效率。
图7 肿瘤免疫治疗靶点的空间表达分析
总结
肿瘤亚群空间分布不均匀和免疫治疗相关靶分子空间分布不均匀可能是治疗效果不佳的原因。在抑制剂和免疫检查点药物的选择上，不同状态的 TMEs 对药物的反应可能完全不同，CAR-T治疗的治疗效果也可能由于 TME 的空间差异而不同。此外，相应的药物和治疗方法可以根据不同 TME的发育阶段进行调整，在肿瘤的精准治疗中具有重要意义。
参考文献
Xia Y, Sun T, Li G, Li M, Wang D, Su X, Ye J, Ji C. Spatial single cell analysis of tumor microenvironment remodeling pattern in primary central nervous system lymphoma. Leukemia. 2023 Jul;37(7):1499-1510. PMID: 37120690; PMCID: PMC10317840.
