创伤后的心肌成纤维细胞退！退！退！

前言

2022年1月美国华盛顿大学Jennifer Davis研究团队在Cell Stem Cell上发表题目为“MBNL1 drives dynamic transitions between fibroblasts and myofibroblasts in cardiac wound healing”的心血管研究文章，该研究发现心脏创伤后愈合过程中MBNL1能够驱动成纤维细胞和肌成纤维细胞之间的动态转换。该发现为逆转心脏创伤后心肌纤维化的进程提供了新的解决思路。

背景介绍

心脏疾病的核心问题是健康的心肌组织被纤维化的疤痕组织所替代。虽然创伤后自我修复形成的瘢痕可防止心肌梗死后心脏破损，但它会引起血流动力学障碍和心律失常最终导致心脏衰竭。瘢痕的形成源于Tcf21和Pdfgra系的心脏固有成纤维细胞的动态变化，这些成纤维细胞在损伤后增殖，然后转化为肌成纤维细胞。有研究表明，肌成纤维细胞的状态实际上是不稳定和可逆的，取决于前纤维性刺激后未知分子机制的运作。

MBNL（musclebind-like protein）盲肌样蛋白家族是一类RNA结合蛋白，MBNL1通过稳定、剪接、聚腺苷酸化和定位靶mRNA调节转录。有研究表明肌强直性营养不良以及红细胞和肌成纤维细胞发育缺陷与MBNL1介导的创伤后愈合失调有关。MBNL1基因敲除的小鼠损伤后肌成纤维细胞密度和纤维化疤痕均降低。

在成纤维细胞转化为肌成纤维细胞的过程中，所需的转录本如血清反应因子（SRF）和钙调神经磷酸酶（CnA）被MBNL1稳定或交替拼接。这些研究均表明MBNL1在促进心脏纤维化状态和纤维化中起着重要的作用。

        

亮点要素

1.MBNL1调控心脏成纤维细胞终态并调节瘢痕形成和成熟
2.MBNL1调节心肌梗死诱导的心脏成纤维细胞的增殖
3.MBNL1是诱导和维持成熟的肌成纤维细胞状态的关键分子
4.MBNL1能够稳定成纤维细胞激活（纤维化）状态下的转录本

研究思路

• 通过批量的转录组测序发现MBNL1在激活的肌成纤维细胞中上调，并在心肌梗死修复过程中与成纤维向肌成纤维细胞状态的转变相符合，确定MBNL1在细胞动态转换之间起到重要作用。（确定基因）

• 构建MBNL1过表达心脏成纤维细胞特异性转基因鼠与MI模型鼠，FACS分选心脏成纤维细胞并测序，发现MBNL1能够使肌成纤维细胞相关的转录本上调。又在MBNL1过表达的基础上构建MI模型小鼠，采用胶原及增殖荧光染色等方法，明确了MBNL1抑制MI诱导成纤维细胞增殖并稳定瘢痕的作用。（基因up验证）

• 构建MBNL1条件性敲除小鼠，通过染色及心脏超声发现MBNL1缺失在心梗情况下减少纤维化及肌成纤维细胞增殖、减轻心室扩张、改善收缩功能。与对照小鼠相比，敲除小鼠成纤维细胞分化缺陷且纤维化瘢痕组织形成不良，又通过感染过表达SRF腺病毒恢复了转化为肌成纤维细胞的能力。（基因down验证）

• 对MBNL1缺失的MI小鼠心脏进行单细胞测序分析各细胞发展情况，发现MBNL1缺失后MI小鼠心脏重新部署了损伤后修复的体系。其中与纤维化有关的基因下调，与EMT及心外膜发育有关的上调，提示了无MBNL1在损伤后修复中的优势。（单细胞宏观动态分析）

• 为了探究MBNL1的作用机制，对结合因子、分化诱导基因以及M基因数据库进行挖掘。发现Sox9满足条件且是EMT和肌成纤维细胞形成的必需转录因子并进行mRNA衰减实验验证。（探索机制）

 

研究内容

对4、14、28天的心梗小鼠肌成纤维细胞进行批量的转录组测序，发现在梗死修复过程中，肌成纤维细胞转录组的动态变化与成纤维细胞增殖、肌成纤维和母纤维细胞的相互转变相符合。在损伤修复过程中，参与正常成纤维细胞功能的基因下调，与ECM相关的基因上调，细胞周期基因先高表达再下降，提示了成纤维细胞先增殖又被抑制的情况。为了比较静止和激活的心脏成纤维细胞之间的基因表达差异，构建了它莫昔芬诱导的荧光报告转基因小鼠标记激活的成纤维细胞。FACS分离两种状态的细胞并检测，发现MI后postn追踪的激活成纤维细胞中代表性肌成纤维细胞基因（Col1a1、Acta2等）显著上调，并且MBNL1基因表达在第4天和第14天在激活的肌成纤维细胞中也升高。证明了MBNL1活性与损伤后修复的肌成纤维细胞的形成有关。

为了验证MBNL1过表达是否能将心脏成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，研究者构建了特异性过表达MBNL1转基因小鼠。对其心脏成纤维细胞测序分析，发现过表达MBNL1的小鼠成纤维细胞中上调的一些转录本是肌成纤维细胞的标志性基因，与梗死的对照小鼠的成纤维细胞状态相似，这表明了MBNL1的过表达能将正常成纤维细胞诱导为心梗后成纤维细胞的类似状态。虽然状态相似，但心脏纤维化、aSMA+肌成纤维细胞数量或心脏结构功能方面差异不明显，研究者推测需要额外的刺激来实现生理性肌成纤维细胞的表型。随后应用了TGF-β处理增加aSMA+应力纤维，并联合SRF处理增加硬度。在该过程中发现SRF作用于MBNL1的下游，敲低SRF会阻断了TGF-β介导的过表达MBNL1心脏成纤维细胞的分化。

图2.心脏成纤维细胞特异性MBNL1过表达诱导肌成纤维细胞表型

为了建立纤维化表型，对MBNL1过表达转基因小鼠进行心肌梗死手术发现MI显著上调转基因小鼠心脏成纤维细胞中的几个典型胶原基因。CLIP-seq结果显示MBNL1定位在胶原和纤维连接蛋白等分泌因子上，并且在MI一段时间后过表达MBNL1的心脏瘢痕与对照组相比更成熟，可能是由于Tg心脏成纤维细胞中有关基质成熟因子（Lox和Runx1）的过表达。通过染色测量PDGFRa+、EdU+细胞的数量发现，Tg小鼠成纤维细胞的增殖能力与对照相比显著降低；RNA-seq分析显示，MI后Tg心脏成纤维细胞中阳性细胞周期调控因子均下调，而细胞周期抑制因子显著上调，可能是由于过表达MBNL1诱导了细胞凋亡或抑制伤口愈合的增殖期限制了成纤维细胞数量。这些数据表明，过表达MBNL1小鼠成纤维细胞增殖减少阻止了MBNL1表达和MI损伤对肌成纤维细胞密度和瘢痕生成的叠加效应。

图3.心肌成纤维细胞中过表达MBNL1可阻止MI依赖性的成纤维细胞增殖

 

构建MBNL1心脏成纤维特异性敲除小鼠，以检测MBNL1对心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞状态转变的重要性。正常心脏成纤维细胞特异性MBNL1缺失不影响心脏功能，但在心肌梗死后，MBNL1缺失小鼠心室不扩张、收缩功能有所改善且纤维化和肌成纤维细胞密度降低了40%，表明MBNL1是肌成纤维细胞形成和纤维化所必需的。Col5a1在MBNL1缺失心脏中显著下调且其ECM中的未成熟胶原纤维较多，胶原纤维宽度和排列也减少，表明MBNL1缺失导致MI后心脏瘢痕发育不成熟和不稳定。由于TGF-β处理能够模拟MI后纤维化形成aSMA+应力纤维，采用SRF腺病毒感染TGF-β处理的成纤维细胞发现：能够被MBNL1稳定的SRF可以拯救TGF-β介导的肌成纤维细胞分化。证明了MBNL1及其下游调控靶点发挥作用，成纤维细胞就能够进行程序化状态转换，由此说明了MBNL1在转换中的重要性。

图4.MBNL1是心脏成纤维细胞状态转变和纤维化瘢痕形成所必需的

EMT调控基因表达的改变并不能确定是由于MBNL1在成纤维细胞转换或心外膜重新激活中的作用。研究者对正常和MI心脏成纤维细胞进行了单细胞RNA-seq (scRNA-seq)测序，发现在MBNL1缺失小鼠中，同时高度表达Sca1和Pdgfra的静止成纤维细胞簇显著增加，这表明MBNL1缺失的静止成纤维细胞簇此时具备了心脏间充质干细胞的特征。而且超过一半的MBNL1缺失心脏成纤维细胞位于较大的激活肌成纤维细胞簇中，许多用于结合拼接的转录本均直接结合并受MBNL1调控。当MI后，MBNL1缺失将60%的心脏成纤维细胞转化为成熟状态，说明MBNL1与MI同时作用将静止的成纤维细胞转换为成熟的肌成纤维细胞状态。心肌梗死后MBNL1功能丧失的影响更为显著，因为整个心脏成纤维细胞群仍处于静止状态，所以MBNL1对于成纤维细胞的转换起到决定性作用。

图5.scRNA-seq显示MBNL1在成纤维细胞和肌成纤维细胞之间起着转录后转换的作用

 

为了评估MBNL1调控的转录本在MI后驱动心脏成纤维细胞状态时的变化，研究者进一步挖掘了三个数据集：MBNL1结合、肌成纤维细胞分化诱导因子、以及MI后MBNL1缺失心脏成纤维细胞中下调的转录本。发现Sox9是同时满足三个条件的关键性因子，它是EMT和肌成纤维细胞形成必需的转录因子。在MI损伤后，Sox9在野生型Postn+肌成纤维细胞中的表达增加了8.5倍，且相对于静止的成纤维细胞，Sox9的表达仍保持升高。相反，在梗死的MBNL1缺失的心脏中，Sox9+和PDGFRa+成纤维细胞的百分比降低了2.5倍。将Sox9转染到心脏成纤维细胞中，足以在体外诱导成aSMA+肌成纤维细胞，表明单独Sox9可促进肌成纤维细胞状态，并可修复MBNL1缺失的成纤维细胞分化缺陷。已有的研究表明MBNL1结合并调控Sox9，由于Sox9与MBNL1的表达同时上调，研究者推测MBNL1可以稳定Sox9的转录。为了验证这一假设，对心肌成纤维细胞进行了mRNA衰减检测，并用腺病毒转染MBNL1 挽救了Sox9的表达，这个操作减缓了两个基因型介导的衰减率。这表明心肌梗死后，MBNL1稳定心脏成纤维细胞中的Sox9转录本，以促进肌成纤维细胞状态的转变。

图6.MBNL1稳定Sox9并促进肌成纤维细胞的形成

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