【Nature】王牌杀手！僵核TCF7L2介导吸烟引起糖尿病的神经机制

众所周知，吸烟有害健康。烟雾中含有焦油、烟碱（又称尼古丁）和一氧化碳，这些化学物质通过不同途径危害身体。其中，烟碱可作用于中枢神经系统，不仅会引起烟瘾[1]，还会影响糖代谢平衡，导致血糖水平升高[2]，长期吸烟则会增加机体患第二型糖尿病的风险[3]。

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研究表明，腹侧被盖区（VTA）表达烟碱型胆碱能受体（nicotine acetylcholine receptor, nAChR）的神经元介导烟碱的成瘾性[4]，内侧缰核（medial hebanula, mHb）nAChR阳性神经元介导烟碱的厌恶性反应[5]。但是，有关烟碱如何作用于神经系统以破坏机体糖代谢平衡，我们尚未可知。

烟碱型胆碱能受体

近期研究发现，烟碱激活后脑胰高血糖素样肽1（GLP-1）阳性神经元，这些神经元投射到脚间核（IPn）并释放GLP-1，增强mHb在此脑区的兴奋性突触传递[6]。而在胰岛β细胞及很多其他组织中，转录因子TCF7L2是胰高血糖素样肽1（GLP-1）信号通路的核心组分[7]，其等位突变与第二型糖尿病密切相关[8]，但TCF7L2在脑中的功能依然不明。

TCF7L2的代谢功能

2019年10月17日，《Nature》杂志在线刊登了西奈山伊坎医学院Paul J. Kenny研究组的最新重要工作[10]，他们发现TCF7L2在mHb神经元中大量表达，此转录因子通过cAMP通路作用于nAChR，进而介导烟碱升高血糖这一过程。该研究首次揭示TCF7L2在脑中的功能，亦首次发现烟碱引起血糖水平升高的分子、环路机制，极大提高了人们在烟瘾、血糖调节领域的认知。

Paul J. Kenny, PhD
结果 1.TCF7L2在mHb中大量表达

首先，通过翻译核糖体亲和纯化（TRAP）技术，作者发现TCF7L2在 mHb胆碱能神经元中大量表达，而在皮层、海马、纹状体中表达量较低（图1a-e）。然后，作者探究TCF7L2是否调控机体对烟碱的摄取过程。他们引入Tcf7l2突变鼠，发现这种大鼠的烟碱摄取量显著高于正常大鼠，而对食物的摄取量与正常大鼠相似（图1f-i）,表明TCF7L2对烟碱摄取的调控作用具有一定特异性。

图1 TCF7L2在mHb中大量表达 2.mHb神经元中TCF7L2调控烟碱摄取过程

前文的方法降低了所有细胞中TCF7L2的表达量，为进一步探究mHb神经元中TCF7L2的功能，作者使用CRISPR-Cas9系统降低TCF7L2表达，他们在spCas9-eGFP小鼠的mHb中注射AAV-Cre和AAV-sgRNA-Tcf7l2，发现这些小鼠的烟碱摄取量显著提高，而食物摄取量不变（图2a-g）。他们还使用了siRNA方法降低mHb神经元中TCF7L2表达，得到相似结果（图2h-k）。以上结果表明，mHb神经元中TCF7L2调控机体对尼古丁的摄取。
为进一步探究上述现象的相关机制，作者使用膜片钳电生理方法记录大鼠mHb神经元。在正常大鼠脑片中，在mHb施加烟碱增加在IPn神经元中记录到的自发兴奋性突触后电流（sEPSC）的频率；而在TCF7L2突变鼠脑片中，在IPn神经元中记录到的sEPSC并不受施加的烟碱影响（图2l-o）,表明mHb神经元中TCF7L2可调控烟碱对mHb-IPn环路的激活作用。

图2 mHb神经元中TCF7L2调控烟碱摄取过程 3.mHb神经元中TCF7L2调控nAChR的功能

过去的研究表明，mHb中nAChR阳性神经元介导烟碱的厌恶性反应[5]。为探究mHb神经元中nAChR功能是否受TCF7L2调控，作者使用膜片钳电生理方法记录大鼠mHb神经元，发现在高频施加尼古丁条件下，记录到的nAChR电流的幅度显著减低。而在随后低频施加尼古丁的条件下，正常大鼠mHb神经元中记录到的nAChR电流迅速恢复至本底水平，而TCF7L2突变鼠mHb神经元中记录到的nAChR电流无法完全恢复（图3a-c），表明TCF7L2调控mHb神经元nAChR失敏后的恢复过程。

图3 mHb神经元中TCF7L2调控nAChR的功能 4.mHb神经元中TCF7L2调控cAMP信号

接下来，作者进一步探究mHb神经元中TCF7L2调控nAChR的分子机制。因为TCF7L2是一种转录因子[11]，因此TCF7L2突变鼠mHb神经元中多种基因的表达水平会出现变化，这些基因可能介导TCF7L2对nAChR的调控作用。他们使用RNA测序结合KEGG分析方法探究mHb、 IPn和海马中表达水平显著下调的基因，发现TCF7L2突变鼠mHb神经元cAMP信号显著下调（图4d-f）。
然后，作者通过药理学方法验证上述结论。他们发现，施加EX-4增加正常大鼠而非TCF7L2突变鼠mHb组织中cAMP的表达水平；施加cAMP类似物8-Br-cAMP可恢复TCF7L2突变鼠mHb神经元中nAChR的失敏效应；施加Rolipram增加大脑cAMP表达水平可降低TCF7L2条件敲除鼠的烟碱摄取量（图4h-k）。
以上结果表明，mHb神经元中TCF7L2通过调控cAMP信号进而调节烟碱受体nAChR的功能（图4g）。

图4 mHb神经元中TCF7L2调控cAMP信号 5.mHb神经元中TCF7L2参与烟碱对血糖水平的调控过程

鉴于烟碱增加吸烟者的血糖水平[2]，吸烟者患第二型糖尿病的风险更高[3]，以及TCF7L2等位基因与第二型糖尿病密切相关[8]，作者推测mHb神经元中TCF7L2可能会参与烟碱对血糖水平的调控作用。为证实此推测，作者展开以下研究。
他们发现，摄入高浓度烟碱增加大鼠血糖水平，而摄入低浓度烟碱则不会（图5a-c）。然后，他们在大鼠IPn中注射逆行表达病毒AAV-retro-Cre，在mHb中注射AAV-DIO-hM3Dq，发现激活投射到IPn的mHb神经元显著增加大鼠血糖水平，与摄入高浓度烟碱的效应相似（图5d-f）。他们还发现，在mHb中注射EX-4后，低浓度烟碱亦可增加大鼠血糖水平；通过shRNA降低mHb中GLP-1受体的表达水平后，或通过siRNA降低mHb中TCF7L2的表达水平后，抑或腹腔注射无法通过血脑屏障的Atenolol后，烟碱不再增加大鼠血糖水平（图5g-j）。此外，在胰腺中注射pRV-GFP以跨多级逆行示踪支配胰腺的神经元，发现mHb和IPn中均有GFP阳性神经元（图5k-l）。
以上结果表明，烟碱通过作用于mHb-IPn环路以调控胰腺对血糖水平的调节，此过程依赖于GLP-1和TCF7L2。

图5 mHb神经元中TCF7L2参与烟碱对血糖水平的调控过程 6.TCF7L2调控烟碱长期作用对机体血糖水平的影响

最后，作者探究血糖水平对烟碱摄取的反作用。作者让大鼠长期（连续3周）摄入烟碱以模拟长期吸烟的烟民，发现长期摄入烟碱的大鼠的空腹血糖水平显著升高（图6a-c），胰岛素和胰高血糖素的释放量亦显著增加（图6d-e），此效应在烟碱戒断后可维持1个月之久（图6f-h）。而对于TCF7L2突变鼠，长期摄入烟碱反而降低胰岛素和胰高血糖素的释放水平（图6i-k），可能由TCF7L2突变导致机体血糖调控的内稳态失衡所致。

图6 TCF7L2调控烟碱长期作用对机体血糖水平的影响
总结

长期吸烟的烟民患第二型糖尿病的概率远高于不吸烟的人，但其相关机制尚未可知。本篇文章结合病毒注射、基因编辑、RNA测序、化学遗传学、血糖检测等多种方法，发现mHb神经元中TCF7L2通过cAMP调控nAChR的活性，从而调控mHb-IPn环路功能，进而介导烟碱对血糖水平的调节作用。这项研究阐释了烟碱升高机体血糖水平的分子、环路机制，揭示了长期吸烟者患第二型糖尿病概率更高的诱因，也让我们更加理解——吸烟有害健康！

图7 烟碱升高机体血糖水平的分子、环路机制

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参考文献
1.Stolerman, I.P. and M.J. Jarvis, The Scientific Case That Nicotine Is Addictive. Psychopharmacology, 1995. 117(1): p. 2-10.
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8.Fuchsberger, C., et al., The genetic architecture of type 2 diabetes. Nature, 2016. 536(7614): p. 41-47.
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10.Duncan, A., et al., Habenular TCF7L2 links nicotine addiction to diabetes. Nature, 2019. 574(7778): p. 372-377.
11.Murray, K.D., P.V. Choudary, and E.G. Jones, Nucleus- and cell-specific gene expression in monkey thalamus. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007. 104(6): p. 1989-94.