“无限联想”--大麻素受体CB1R的新功能

日常生活中，联合学习无处不在，其本质就是感觉刺激与负面的（如危险、惩罚）或奖励的行为联合形成的记忆，其中最典型的例子就是“一朝被蛇咬，十年怕井绳”，这些学习模式能够决定我们的行为选择。

然而，实际上，除了上述直接的联合学习，介导学习（Mediated learning）更多地决定我们的行为反应。介导学习是一类将不够明显的感觉信息与之前的联合记忆耦联在一起的学习范式。这是一种经验上的积累，依赖于发生联合学习时环境中的弱刺激，能够对未来的生活经验和联想带来提示。

例如，经典的巴甫洛夫条件反射实验中，狗听到铃声与肉形成的就是联合学习，而发生铃声的环境中、其他的感觉刺激，如铃铛的颜色、天气情况等则可能形成介导学习。

目前，人们对联合学习的生物学机制关注密切，但是对介导学习的神经机制知之甚少。

2018年8月30日，波尔多大学Guillaume Ferreira研究组利用感觉预条件刺激范式（Sensory precondition test）[1]，系统研究介导学习与海马GABA能神经元大麻素I受体（Type 1 cannabinoid receptors, CB₁R）的重要关系，他们的成果发表在《Neuron》杂志上[2]。             

大麻素，从印度大麻里提取的一组萜酚类化合物，广泛存在于动物神经和免疫系统里。CB₁R则主要存在于基底神经节和边缘系统。此前，上海科技大学解析出人源大麻素受体三维精细结构，并将成果发表在《细胞》(Cell)杂志上[3]，这有利于我们更好的利用大麻素受体的作用机制为人类造福。

大麻素受体

结果

Part.1  CB₁R是介导学习的必要因素

通过感觉预条件刺激实验（图1A）,作者观察到野生型小鼠经CS （条件刺激）或mCS （介导性条件刺激）均消耗较低的味道或气味量，这表明野生型小鼠已形成明显的介导性厌恶学习和直接厌恶学习。有趣的是，CB₁R敲除小鼠（CB₁R-KO）经CS 表现出直接学习能力，但mCS 作用不明显（图1B-E），这表明CB₁R是介导学习的必要因素。

 图1 CB₁R是介导学习的必要因素

Part.2 预条件刺激处理阶段激活CB₁R是介导学习的必要条件

CB₁R-KO鼠长期缺失CB₁R，为排除其带来的慢性影响，作者在预条件刺激前使用Rimonabant（CB₁R拮抗剂，图2A）阻断CB₁R的作用。结果发现，该操作导致介导学习受损，但对直接厌恶学习无影响（图2B-E）。

此外，在测试前使用Rimonabant对气味或味道厌恶没有影响（图2F-G），这表明CB₁R激活是此类联想型的记忆形成所必需的。接下来，作者进一步探究CB₁R激活在其他感觉刺激（视觉和听觉）以及非条件刺激（食物奖励）是否发挥同样的作用（图2H），结果与上述一致（图2I-J），提示介导学习依赖于CB₁R在联想记忆形成过程中的激活，且不局限特定的感觉刺激或非条件刺激。

图2 在预条件刺激阶段激活CB₁R是介导学习的必要条件

Part.3  海马CB₁R是介导学习过程中的关键因素

海马是学习记忆形成的核心脑区，因此作者向CB₁R-flox小鼠海马区注射含Cre重组酶和GFP蛋白的AAV病毒载体（图3A），定点敲除海马区神经元的CB₁R蛋白，结果发现该小鼠介导性厌恶学习显著受损（图3B-C）。接下来，作者利用病毒载体在CB₁R-KO小鼠海马体中重新表达CB₁R（图3D）进行恢复实验，结果发现小鼠的介导学习能力恢复（图3E），这进一步验证了海马CB₁R与介导性学习的密切关系。

图3 海马CB₁R活动是介导学习的关键因素

Part.4  GABA能神经元上CB₁R与介导学习密切相关

海马中大部分的CB₁R存在于GABA能神经元上，因此，进一步的实验中，作者在前脑GABA能神经元CB₁R缺失的突变小鼠（Dlx5/6-CB₁R-KO小鼠）进行测试，并发现了与上述结果一致的现象（图4A-D）。此外，小鼠前脑GABA能神经元表达CB₁R（GABA-CB₁R-RS小鼠）后发现其具有正常的气味或味道介导性厌恶，同时直接厌恶学习没有影响（图4E-H）。这些数据进一步提示GABA能神经元CB₁R与气味-味道刺激介导的学习密切相关。

图4 GABA能神经元上CB₁R与介导学习密切相关

Part.5 海马神经元CB₁R受预条件刺激影响

接下来，作者探索上述行为的海马神经机制（比如蛋白合成、突触可塑性）。

作者发现气味-味道的配对可以显著增加海马中CB₁R的表达（图5A）。感觉预条件刺激可以增强野生型小鼠海马神经元LTP，但GABA-CB₁R-KO小鼠则无此现象（图5B-C）。接下来，他们发现两种高频刺激可以诱导对照小鼠中71%锥体细胞的I-LTD（长时程抑制效应，图5D-E）。进一步表明气味-味道配对可以增加CB₁R蛋白合成、CREB磷酸化、LTP以及海马区内源性大麻素依赖的I-LTD。

鉴于CREB磷酸化和LTP同样可以受到低阈值感觉刺激（气味或味道）的影响，CB₁R表达的增强和I-LTD的增加与感觉预条件刺激密切相关，这提示它们参与介导学习。

图5 海马中的CB₁R受感觉预条件刺激的影响

Part.6 特异性海马GABA能中间神经元调控偶然联想的形成

最后，作者运用化学遗传技术（图6A），将含DIO-hM4Di元件的AAV病毒载体注入到GABA-CB₁R-KO小鼠的海马区，使其在海马GABA能神经元上特异性表达DREADD-Gi。通过CNO抑制GABA能神经元，作者发现在上述记忆形成的过程中，过量的抑制性神经递质可能是导致介导学习受损的原因（图6B）。进一步，通过共定位，作者发现海马PV阴性GABA能中间神经元参与弱感觉刺激之间的联合，最终促成介导学习和记忆的形成（图6D）。

图6 特异性海马GABA能中间神经元调控偶然联想的形成

结果

在人们的日常生活中，那些不太受我们关注的弱感觉刺激往往不受重视，但很多时候，这些弱刺激会促进我们联想，本实验发现海马GABA能神经元CB₁R参与此类学习。重要的是，这种介导型学习状态的异常被发现存在于一些神经系统疾病，这意味着，通过CB₁R特异性调控海马抑制性递质传导可能可以作为某些认知功能障碍的潜在靶点。

此外，文中使用Flox鼠或Cre鼠配合AAV病毒载体实现特定脑区的基因敲除或基因表达，此类策略是目前神经科学常用的技术手段，值得推广关注。

参考文献

[1] Busquetsgarcia A, Soriagómez E, Ferreira G, et al. Representation-mediated Aversion as a Model to Study Psychotic-like States in Mice.[J]. Bio Protoc, 2017, 18(10):2044.

[2] Busquets-Garcia et al. Hippocampal CB1 Receptors Control Incidental Associations.[J]. 2018, Neuron 99, 1–13.

[3] Hua T, Vemuri K, Pu M, et al. Crystal Structure of the Human Cannabinoid Receptor CB1.[J]. Cell, 2016, 167(3):750-762.e14. 

[4] Robinson S, Todd T P, Pasternak A R, et al. Chemogenetic silencing of neurons in retrosplenial cortex disrupts sensory preconditioning[J]. Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience, 2014, 34(33):10982-8.